Das Protein C – S System

Protein C

Historisches: 1960 identifizierte der deutsche Mediziner Eberhard Mammen ein Antikoagulans, das sich spontan während einer Inkubation seiner Prothrombinpräparation entwickelte. Er nahm an, dass dieses Antikoagulans wie ein kompetitiver Inhibitor bei der Prothrombinaktivierung fungiere. Das Protein wurde von ihm und seinen Mitautoren „Autoprothombin II A“ genannt. Diese Entdeckung wurde zunächst nicht gemäß ihrer Bedeutung gewürdigt, weil das damalige Verständnis der Gerinnung noch sehr lückenhaft und wenig biochemisch geprägt war.

1976 isolierte der Wissenschftler Johan Stenflo aus Rinderplasma das Protein C, das seinen Namen auf Grund der Tatsache erhielt, dass es in der 3. Fraktion (C-Fraktion) einer DEAE-Säulenchromatographie eluierte. Die Tatsache, dass dieses Protein zu den Vitamin-K-Abhängigen gehörte und Vorläufer (Zymogen) einer Serinesterase war, die sich an Phospholipidmizellen binden konnte, führte zu einer intensiven Erforschung seiner Funktion. Neben den bekannten Vitamin-K-abhängigen Proteinen: Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX und X gab es nun eine 5. Serinprotease, das Protein C. Durch vergleichende Untersuchungen konnte Seegers zeigen, dass das neue Protein C der inaktive Vorläufer des von ihm und seinen Mitautoren beschriebene Autoprothrombin II A war.

Walter Kisiel konnte 1976 zeigen, dass durch Einwirken von α-Thrombin auf humanes Protein C ein aus 12 Residuen bestehendes Peptid freigesetzt wird. Dies geschieht bei gleichzeitiger langsamer Aktivierung des Protein C zu Protein Ca (APC).

1979 konnte Walker beweisen, dass APC imstande war, bovinen Faktor Va zu zerstören, indem er die schwere Kette des Proteins an definierter Stelle zerschnitt.

Struktur und Funktion: Protein C ist ein in seiner Synthese ein Vitamin-K-abhängiges Protein mit einer molaren Masse von 62.000 Daltons. Es wird in den Hepatozyten synthetisiert und liegt im Plasma in einer Konzentration von 60 nMol vor.

Seine Funktion ist die Downregulierung des aktivierten Gerinnungssystems, indem es im Verbund mit dem Protein S die Prothombinase inaktiviert.
Das Protein verfügt über 3 Domänen: die membranbindende Gla-Region (Gamma-carboxyglutaminsäure), die calciumbindende endotheliale Wachstumsfaktor-Region (EGF) und die Serinprotease-Region, die Ähnlichkeiten zum Trypsin besitzt.

An Thrombomodulin gebundenes Thrombin aktiviert das Protein C, indem es ein Aktivierungpeptid aus der Serinproteaseschleife des Protein C herausschneidet.

Diese Reaktion erfordert die Gegenwart von Calzium-Ionen.

Protein C verfügt über mehrere Calcium-Bindungsstellen: in der Gla-Domäne, in der ersten EGF-Domäne und in der Proteasedomäne. Die metallbindenden Seiten der Gla-Domäne dienen der Bindung des Proteins an Phospholipide und den endothelialen Protein C Rezeptor (EPCR). Mutationen in der Gla-Domäne lassen die Vermutung aufkommen, dass die N-terminale Hälfte der Domäne essentiell für die Interaktionen mit Membranen ist. Mutationen der Gla-Residuen 7, 20, 26 und 29 führen zu einem kompletten Verlust der antikoagulativen Aktivität. Ferner ist die Disulfid-Bindung in der Gla-Domäne essentiell für die Funktion des Protein C.

Für die Funktion des Protein C ist die Anwesenheit von Phospholipidvesikeln, die Phosphatidylethanolamin enthalten, von großer Bedeutung, da auf diesen Vesikeln die Aktivierung des Protein C mit hoher Geschwindigkeit abläuft. Antikörper gegen Phosphatidylethanolamin, die im Verlaufe eines Antiphospholipidsyndroms auftreten können, blockieren die Bindungsstellen des Protein C und sind somit hochgradig thrombogen.

Glucosylceramide steigern ebenfalls die Funktion des Protein C. Niedrige Konzentrationen dieser Lipide im Serum sind ebenfalls mit einem erhöhten Thromboserisiko verbunden.

Die 24 C-terminalen Aminosäuren sind offenbar notwendig für die Bindung an phosphatidyl-aethanolamin-haltige Vesikel sowie für die Protein S-abhängige Steigerung der Faktor Va-Inaktivierung und die Funktion des Protein S als Antikoagulans.

Historisches: Protein S (PS) wurde 1977 von Dr. Rickard Di Scipio und Dr. Earl Davie als ein neues Vitamin K-abhängiges Glykoprotein entdeckt, das Gamma-Carboxyglutamin-Reste (GLA-Residuen) enthält, jedoch keine Serinprotease ist. Weitere Studien zeigten, dass PS ein wichtiger Co-Faktor des Protein C bei der Inaktivierung des aktivierten Faktors V ist. Familienstudien von Thrombosepatienten erbrachten den Hinweis, dass PS-Mängel mit einem hohen Thrombophilierisiko assoziiert sind.

Struktur und Funktion: Protein S ist ein in seiner Synthese Vitamin-K-abhängiges Protein, das in den Hepatozyten gebildet wird. Es gehört – wie auch Protein C – zur Familie des Prothrombinkomplexes. Diesem gehören folgende Gerinnungsfaktoren an: Prothrombin (Faktor II), Faktor VII (Proconvertin), Faktor IX (Christmas-Faktor), Faktor X (Stuart-Prower-Faktor). Diesen Proteinen gemeinsam sind sogenannte GLA-Regionen, die es den Proteinen ermöglichen, sich via Kalzium-Ionen an negativ geladene Phosphatidmembranen zu binden.

Das Protein S Gen besteht aus 15 Exonen:

· Das Exon 1 enthält die Translationsstartseite und das Signalpeptid.

· Das Exon 2 enthält das Propeptid. Das Signalpeptid und das Propeptid werden vor der Sekretion proteolytisch abgetrennt. Daraus resultiert das reife einkettige, multi-modulare Protein S. Es besteht aus 635 Aminosäuren und hat eine molare Masse von 75kDa.

· Das 3-Ende von Exon 2 und Exon 3 codieren für die Gla-Domäne. Die Gla-Domäne enthält 11 Gamma-Carboxyglutaminsäurereste. Sie dient der Interaktion des PS mit aktivierten (negativ geladenen) Membranphospholipiden via Calcium-Ionen. Über diese Domäne wird aktiviertes Protein C (PCa) auf Membranen fixiert.

· Das Exon 4 codiert für die sog. Thumb loop, der Bereich in dem die Interaktion mit dem PCa stattfindet. Diese Region kann durch Thrombin zerstört werden (Thrombinsensitive Region). Die Thumb loop stabilisiert die Gla-Domäne und steigert ihre Affinität, Calcium-Ionen zu binden. Sie hat keine direkte Interaktion mit Phospholipiden. Membrangebundener Faktor Xa schneidet in der Thumb loop die Arg101-Gln-Bindung, was ebenfalls zum vollständigen Verlust der PS Cofaktoraktivität führt.

· Die Exone 5 bis 8 codieren jeder für sich für eine endotheliale Wachstumsfaktor (EGF)-ähnliche Domäne, eine der häufigsten Strukturmodule, die man in Transmembranproteinen und extrazellulären Proteinen findet. Drei der EGF Module binden kooperativ Calcium-Ionen mit hoher Affinität, was für die antikoagulative Funktion des PS von großer Bedeutung ist.

Die carboxyterminale Hälfte von PS ist in den Exonen 9 bis 14 und im 5 ́Terminus von Exon 15 encodiert. Diese Region ist komplett different von den anderen Vitamin-K-abhängigen Proteinen. Sie gleicht der globulären Domäne von Laminin A. Sie wird in Proteinen der extrazellulären Matrix gefunden u.a. in dem Sexualhormon bindendem Globulin (SHBG). Wegen der Ähnlichkeit wird diese Region von PS SHGB-like Domäne genannt. Sie hat eine hohe Affinität zum C4 binding Protein.

Protein S kommt im Plasma in freier Form und gebunden an das C4 binding Protein (C4bP)vor. Nur die freie Form ist inhibitorisch aktiv.

Die PC-PS-mediierte Down-Regulierung der Gerinnung

Das PC-PS-Inhibitor-System ist offenbar überwiegend nur in den großen Gefäßen aktiv, weil hier der endotheliale Protein C-Rezeptor (EPCR) exprimiert wird. Protein C bindet sich an den EPCR – sofern er exprimiert wird – und wird dann durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex aktiviert. Sobald das aktivierte Protein C vom EPCR dissoziiert, verbindet es sich mit dem Protein S und zerstört durch eine gezielte Proteolyse den Faktor Va und den FVIIIa. Hierdurch werden die Prothrombinase und die Tenase inaktiviert. Das aktivierte Gerinnungsystem wird auf diesem Weg herunter reguliert.

Hereditäre Defekte, die die Funktion des PC-PS-Systems beeinträchtigen

1. Die häufigste Ursache für einen Funktions-Defekt im PC-PS-System ist eine autosomal dominant vererbte Mutation im FV-Gen (dem Substrat von PCa). Mittels Genotypisierung wird bei pathologischer APC-Resistenz die heterozygote Mutation c.1601G>A, p.R534Q im Exon 10 des Gerinnungsfaktors V (auch Faktor V-Leiden genannt) nachgewiesen. Diese Punktmutation bewirkt, dass die Aminosäure Arginin in Position 534 des Faktors V durch Glutamin ersetzt wird. Die Folge ist, dass das aktivierte Protein C den FVa nicht an seiner Prädilektionsstelle spalten und damit nicht inaktivieren kann. Der Prothrombinaktivatorkomplex, bestehend aus FXa- Phospholipiden und FVa, bleibt weiter aktiv und wirkt dadurch thrombogen. Die Prävalenz der heterozygoten Mutation liegt zwischen 6 und 7 % in der hiesigen Bevölkerung. Für die Homozygoten wird eine Prävalenz von 0,00001 bis 0,00002 % angegeben. Das Risiko für die heterozygoten Patienten, an einer Thrombembolie zu erkranken, ist 6 bis 8 mal höher als bei Nichtmutierten. Homozygote Anlageträger haben dagegen ein 50- bis 100-fach höheres Risiko.

2. Der Protein S-Mangel ist die zweithäufigste Ursache für ein Versagen des PC-PS-Systems. Die autosomal rezessiv vererbten Defekte können ihre Ursache in Punktmutationen in den verschiedenen Exonen des PS-Gens haben. In seltenen Fällen sind aber auch Insertionen oder Deletionen innerhalb des PS-Gens als Ursache für eine defekte Proteinbiosynthese nachgewiesen worden.

Heterozygote Anlageträger sind mit einer Prävalenz von 0,16 – 0,21 % zu erwarten, homozygote Anlageträger mit einer Prävalenz von 1:500.000.

Während heterozygote Anlageträger meist erst im späteren Leben thrombembolische Ereignisse erleiden (Inaktivierungen, Operationen, Unfälle, Schwangerschaften), können Homozygote bereits im Neugeborenenalter die gefürchtete Purpura fulminans erleiden. Hierbei kommt es zu ausgedehnten Gerinnungsprozessen im Gefäßsystem, das zu schwersten Nekrosen führt.

3. Klinisch bedrohlich sind Mängel an Protein C. Die physiologische Funktion des aktivierten PC ist neben der Hemmung der Gerinnung, die Aktivierung der Fibrinolyse durch Hemmung des PAI1 und eine antiinflammatorische Wirkung.

Angeborene homozygote Mängel sind selten und weisen eine Prävalenz von 1:160.000 auf. Bei Neugeborenen führt dieser Defekt zu einer unkontrollierten Aktivierung der Blutgerinnung mit Thrombosierung der Hautgefäße, um dann auf weitere Organe überzugreifen. Es entsteht die Purpura fulminans, die zum Multiorganversagen führt.

Angeborene heterozygote Mängel weisen eine Prävalenz von 1:200 auf. Heterozygote Anlageträger sind gefährdet, Thrombosen in den Bein- und Beckenvenen sowie Lungenembolien zu erleiden. Besonders gefährdet sind Frauen während einer Schwangerschaft.

Erworbene Mängel an PC finden sich bei Lebererkrankungen zusammen mit Mängeln der Faktoren des Prothrombinkomplexes.

Da PC eine sehr kurze Halbwertszeit im Plasma hat (6 Stunden, ähnlich wie FVII) kann es bei der Neueinstellung von Patienten mit Cumarinderivaten zu thrombotischen Entgleisungen kommen (Cumarinnekrosen), die durch einen Mangel an PC bei sonst noch funktionsfähigem Gerinnungssystem bedingt sind.